artikel
‘Niet besmet, toch positief getest’ kopte NRC Handelsblad op 11 september. Sindsdien is er discussie over de specificiteit van de PCR-test voor SARS-CoV-2. Voor elke diagnostische test geldt dat een suboptimale specificiteit problematisch is wanneer de prevalentie van de ziekte daalt: op een gegeven moment zijn er meer fout-positieven dan zieken. Maar geldt dat ook voor de PCR-test voor SARS-CoV-2? Hoe werkt die test en wanneer spreken we van een positieve uitslag? En hoe problematisch is dat? Een bericht uit het lab waar ik bijles kreeg van mijn collega arts-microbioloog Marije Hofstra.
De test
Veel laboratoria hebben – op hun eigen manier – in februari en maart van dit jaar een infrastructuur opgetuigd in het kader van de PCR-test voor SARS-CoV-2, met als primaire doel om het virus zo snel mogelijk aan te tonen. Daarvoor wil je vooral een hoge sensitiviteit. Bij de PCR-test voor SARS-CoV-2 gebruiken we in het UMC Utrecht 3 stukjes van het RNA-genoom (het E-, N- en RdRP-gen). De wattenstaaf gaat in keel en neus, dan in een vloeistof en vervolgens naar het lab. Aldaar wordt het RNA geëxtraheerd, waarna het amplificeren van de targets kan beginnen. De ‘cycle threshold’(Ct)-waarde is het aantal amplificatiecycli dat nodig is voor een positief signaal, gemeten als een curve die boven een drempel uitkomt. Analisten zijn getraind in het beoordelen van deze curves om de beoordeling zo uniform mogelijk te maken. Als er na 45 cycli nog steeds niks geamplificeerd is, is de testuitslag negatief.
Een positieve uitslag
Wanneer vinden wij in het UMC Utrecht de testuitslag positief? Hebben alle targets een Ct-waarde < 35 en worden er goede curves gezien, dan is er geen discussie: de testuitslag is positief. Bij Ct-waarden ≥ 35 wordt het lastig en regelmatig hebben 1-2 targets een dergelijke Ct-waarde regelmatig. Curves die in de laatste amplificatiecycli opkomen zijn soms moeilijk te interpreteren, en bij twijfel wordt de test herhaald. Vaak is de uitslag dan opnieuw zwak positief, wat dan toch echt op aanwezigheid van viraal RNA duidt. Wij noemen de testuitslag dan ‘voorlopig positief’. De interpretatie van de curves blijft mensenwerk, en er is dus een kans op een fout-positieve uitslag. Hoe groot die kans precies is, is moeilijk vast te stellen. Daarvoor zou je de test moeten uitvoeren bij duizenden mensen van wie je zeker weet dat ze niet besmet zijn. Onze voorlopig positieve uitslagen verschijnen in de landelijke database – die geraadpleegd wordt door de GGD’en – als ‘positief’, met de opmerking dat er slechts kleine hoeveelheden viraal RNA zijn aangetoond.
De Ct-waarde
De Ct-waarde zegt dus iets over de hoeveelheid RNA in het onderzochte materiaal: een lage Ct-waarde betekent veel viraal RNA, een hoge waarde duidt op weinig viraal RNA. Om die reden hangt de Ct-waarde af van hoeveel virus er in de keel zit en hoeveel daarvan op de wattenstaaf terechtkomt. Dat laatste wordt bepaald door de manier waarop het materiaal wordt afgenomen en vervolgens verwerkt wordt. Hoeveel virus er in de keel zit is afhankelijk van het ziektestadium: na transmissie gaat het virus zich repliceren en neemt de virusconcentratie (‘viral load’) toe, en zodra het afweersysteem de infectie onder controle krijgt neemt de virusconcentratie weer af (figuur). Het rest-RNA van het virus kan nog lang detecteerbaar blijven.
Wanneer is iemand besmettelijk? Als het virus gekweekt kan worden, bevat het materiaal virus dat zich kan repliceren, en dan gaan we ervan uit dat iemand besmettelijk is. Maar het kweken van een virus duurt meerdere dagen en wordt alleen in een onderzoekssetting uitgevoerd. We weten inmiddels dat het virus langere tijd te kweken is bij patiënten met ernstigere symptomen. In studies lukte het kweken niet meer wanneer de Ct-waarde > 29 is. Maar de Ct-waarde kan per monster en per lab verschillen, dus is er geen afkappunt voor besmettelijkheid.
In de praktijk
Na zo’n 60.000 testen zagen we bij ongeveer een kwart van de positieve testuitslagen (400 van bijna 1600) een Ct-waarde > 35 bij één of meerdere targets. De kans op zo’n uitslag is natuurlijk kleiner wanneer niet op 3 maar op 2 targets getest wordt, zoals veel laboratoria doen. Zwak positieve testuitslagen kunnen in werkelijkheid fout-positief zijn, maar ze kunnen ook passen bij een vroege of doorgemaakte infectie (zie de figuur). Om dan de uitslag juist te kunnen interpreteren, heb je aanvullende informatie van de patiënt nodig. Bij een vroege infectie zal de patiënt waarschijnlijk nog besmettelijk worden en adviseren we om de test te herhalen. In de andere gevallen is de patiënt mogelijk niet infectieus. Technisch gezien gaat het dan niet om fout-positieve uitslagen, maar als patiënten niet meer besmettelijk zijn verdwijnt de noodzaak voor isolatie van de indexpatiënt en quarantaine van zijn of haar contacten.
In de monsters die wij via de GGD-teststraat kregen, was bij ongeveer 75% van de positieve uitslagen getest op 3 targets en lag de gemiddelde Ct-waarde op 22-24. In het kader van het bron- en contactonderzoek werd in een steekproef van deze positieve uitslagen bij 75% een positief geteste bron of een positief getest contact gevonden. Bron- en contactonderzoek bij 72 patiënten met een zwak positieve testuitslag leverde vrijwel geen nieuwe positief geteste contacten op. De opbrengst van het bron- en contactonderzoek lijkt bij deze groep dus beperkt
Tot slot
Als we dan toch een uitspraak moeten doen over de kans op een fout-positieve uitslag: die lijkt in elk geval kleiner dan 0,67% (400 van 60.000). Omdat ook hoge Ct-waarden vaak op aanwezigheid van RNA van SARS-CoV-2 duiden, lijkt die kans aanzienlijk lager, maar 100% zekerheid daarover hebben we niet. ‘Niet besmet, toch positief getest’ lijkt een zeldzaamheid. ‘Niet besmettelijk, toch positief getest’ komt daarentegen waarschijnlijk regelmatig voor. Nu we meer inzicht in covid-19 krijgen, kunnen we de testuitslagen beter interpreteren. Het doel van het testbeleid is om transmissie zoveel mogelijk te beperken door zoveel mogelijk verspreiders te traceren en te isoleren. Het missen van mensen met een laag risico op verspreiding is geen ramp en is zelfs te verkiezen als daardoor middelen vrijkomen om meer verspreiders te vinden. Alleen nog maar bron- en contactonderzoek doen bij patiënten met een overtuigend positieve PCR-testuitslag kan de inzet van de GGD verder optimaliseren.
Artikelinformatie
Belangenverstrengeling?
Aangezien deze week het thema belangenverstrengeling is zou ik graag enige vragen willen stellen aan Marc Bonten.
Er luidt veel kritiek op het gebruik van de PCR, zie onder andere het artikel in de tijd. Laboranten die kritiek hebben op de PCR worden helaas op non-actief gesteld. Andere laboranten hebben uit gewetenswroeging ontslag genomen.
Uit de beschikbare data in Engeland bij het gebruik van de PCR test tijdens de Mexicaanse of griep in 2009-2010 bleek dat er weinig correlatie was tussen het aantal positieve testuitslagen en het uiteindelijke aantal doden. Die trend, afwezigheid van correlatie, een te lage sensitiviteit, lijkt nu ook zichtbaar.
Marc Bonten is via het UMC verbonden aan een van de preferente laboratoria welke de PCR test mogen uitvoeren. Hier gaat veel geld in om.
Daarnaast heeft Marc Bonten onderzoek gedaan naar HCQ. Uit zijn onderzoek bleek dat het niet werkzaam was. Dit was erg jammer want er waren vele andere onderzoeken die wel hoopvol waren en landen die het middel hebben gebruikt hebben aanzienlijk minder doden per miljoen inwoners dan landen die het middel niet hebben gebruikt.
Marc Bonten is verbonden aan de farmaceutische industrie. De farmaceutische industrie kan vanuit financieel oogpunt baat hebben bij een vaccin. Hoe langer de pandemie voortduurt hoe groter de kans op een spoedprocedure voor een vaccin. Marc Bonten is lid van het OMT en mag dus mede bepalen of de PCR-test leidend is voor het beleid van de overheid en het voortzetten van PCR-testen. Ook kan hij mede bepalen of veelbelovende behandelingen, zoals HCQ met zink, worden verboden.
Misschien wil Marc Bonten uitleggen hoe hij kan beloven dat er geen sprake is van belangenverstrengeling als hij een beschrijving geeft van het nut en de werking van de PCR-test.?Deze uitleg zal ook van toepassing zijn voor zijn onderzoek naar HCQ.
Misschien kan hij dan tegelijkertijd even de chronologische volgorde toelichten. Namelijk dat Nederland in februari een schip met maskers stuurde naar China waar toen de pandemie heerste en Nederland blijkbaar geen risico liep. In maart werd de samenstelling van het OMT bekend toen toch bleek dat corona ook Nederland had bereikt. Echter, veel leden van het OMT van maart waren reeds begin januari bezig met implementatie van PCR testen voor corona. Enige toelichting over hoe de samenstelling van het OMT tot stand is gekomen en de voorspellende gaven over de noodzaak van PCR testen voor corona lijkt mij daarom wel op zijn plaats, dit om complottheorieën te voorkomen.
Koert van Rijn, arts UWV
reactie auteur
Ik dank collega Van Rijn voor zijn bijdrage en help hem graag in het bestrijden van complottheorieën. Ik ben werknemer van het UMC Utrecht en hoofd van de afdeling medische microbiologie, waar ook diagnostiek van COVID-19, onder andere met PCR, verricht wordt. Ik ben op uitnodiging lid van het OMT.
Mijn potentiele conflicts of interest met de farmacie zijn de volgende:
Ik ben adviseur voor het ontwikkelingsprogramma van een vaccin voor E. coli infecties van Janssen Vaccines en van een vaccin voor pneumokokken van Merck (honorarium gaat naar UMCU). Ik ben lid van de DSMB van een studie met een nieuw influenzacvaccin van Sanofi (honorarium gaat naar UMCU). Ik ben als principal investigator betrokken bij onderzoek dat het UMCU verricht met een kandidaat COVID-19 vaccin in opdracht van Janssen Vaccines en een internationaal epidemiologisch onderzoek op het gebied van pneumonie in opdracht van Merck.
Ik heb geen samenwerking met producenten van PCR testen of hydroxychloroquine, en ook niet met producenten van andere COVID-19 geneesmiddelen of diagnostiek. Ik was niet betrokken bij het schip met mondmaskers dat in Februari naar China gestuurd is of met de samenstelling van het OMT.
Marc Bonten
PCR TEST NIET VERGELEKEN MET GOUDEN STANDAARD
Dank voor uw duidelijke uitleg. Door het afkappunt van de Ct waarde lager te kiezen wordt de kans op een fout positieve uitslag uiteraard ook lager. Maar de echt fundamentele vraag blijft natuurlijk hoe goed de test presteert ten opzichte van de gouden standaard. Met name ten opzichte van het wel of niet aanwezig zijn van het specifieke SARS-CoV-2 virus in infectieuze vorm. Het zou immers kunnen zijn dat de test ook op andere virussen reageert. Zoals u zelf ook aangeeft is dit met de huidige PCR test niet onderzocht. U lijkt hier gemakkelijk overheen te stappen. Maar is dit niet een grote tekortkoming?
Ook zijn fouten in de monsterafname, het gebruik van suboptimale primers, verontreiniging van het monster, fouten in het laboratorium of het misschien minder nauwkeurig aflezen door de laborant voorstelbare factoren die de prestatie van de test nadelig zouden kunnen beïnvloeden.
Hoe precies de test in de werkelijkheid van alle dag uiteindelijk presteert blijft dus vooralsnog een open vraag. Toch wel opmerkelijk voor een test die zo veel impact heeft op ons maatschppelijk leven.
Willem van der Krol, huisarts, Leeuwarden
reactie auteur
Collega van der Krol stipt een aantal relevante aspecten aan, waarvoor dank. Voor deze ziekte hebben we niet echt een gouden standaard, hoewel we de PCR als referentie standaard beschouwen. De PCR toont aanwezigheid van viraal RNA aan, maar dat is niet hetzelfde als aantonen van besmettelijkheid. Ook daarvoor bestaat geen gouden standaard. De beste informatie die we nu hebben is dat levensvatbaar virus gekweekt kan worden uit samples die PCR-positief zijn met een lage Ct waarde (dus met veel virus in het sample). Bij het kiezen van de stukjes RNA voor de SARS-CoV2 is gezocht naar stukjes die specifiek zijn voor dit virus en die niet aanwezig zijn bij de al bekende humane coronavirussen. Een positieve SARS-CoV2 PCR wordt derhalve niet door andere virussen veroorzaakt.
Het klopt inderdaad dat er verschillende stappen in het proces zijn, waardoor de betrouwbaarheid van de testuitslag vermindert. Dat kan resulteren in fout-negatieve uitslagen.
Desalniettemin beschouw ik de PCR, zoals uitgevoerd in Nederlandse laboratoria als zeer betrouwbaar. In elk geval betrouwbaarder dan alle andere testen die we tot nu toe hebben en die op grote schaal uitgevoerd kunnen worden.
Marc Bonten
Landelijke diversiteit PCR test
Dank voor uw toelichting. Ik begrijp dat er geen validatie heeft plaats gevonden ten opzichte van een viruskweek bij patiënten. De ware testeigenschappen zijn daarmee onbekend. U legt uit dat met het gebruik van 3 in plaats van 2 primers de specificiteit in uw eigen laboratorium voldoende gewaarborgd is. Maar op de website van het RIVM lees ik dat laboratoria ook mogen testen met slechts 1 primer (1). Dit zou op zich zelf al tot veel extra fout positieve uitslagen kunnen leiden. Daarnaast is onduidelijk welke maximale Ct waarden worden gehanteerd door de diverse laboratoria. Natuurlijk gaat het ook om de vraag wat men precies wil bereiken met het testen. Wil men elke minimale aanwezigheid van een eventueel zelfs al gedateerd virusdeeltje kunnen aantonen? Wil men de mate van besmettelijkheid kunnen bepalen? Of wil men bij een patiënt met voor Covid-19 verdachte klachten de diagnose met meer zekerheid kunnen stellen? Afhankelijk van de gekozen doelstelling en de daarop afgestemde testmethode zal de uiteindelijke specificiteit van de PCR test bij elk laboratorium weer anders kunnen uitvallen. Zo is het voorstelbaar dat een zelfde persoon bij het ene laboratorium positief getest wordt en bij het andere laboratorium negatief. Ik ben benieuwd naar uw visie in deze.
Willem van der Krol huisarts Leeuwarden
1. https://lci.rivm.nl/covid-19/bijlage/aanvullend