Bepaling van spectrine in erytrocyten: een belangrijk hulpmiddel bij de diagnostiek van hereditaire sferocytose

Inleiding

Inleiding

Erfelijke hemolytische anemieën kunnen worden veroorzaakt door afwijkingen in eiwitten in of direct tegen de membraan van de erytrocyt. Figuur 1 toont de belangrijkste eiwit-eiwit- en eiwit-membraaninteracties die de biconcave vorm van erytrocyten veroorzaken. Drie erfelijke ziektebeelden, te weten hereditaire sferocytose, hereditaire elliptocytose en hereditaire pyropoikilocytose, vinden hun oorsprong in een gestoorde interactie van deze structuurbepalende eiwitten.

Hereditaire sferocytose

Hereditaire sferocytose wordt gekenmerkt door een lichte tot ernstige, erfelijke, hemolytische anemie, soms in combinatie met splenomegalie en aanvallen van geelzucht. In ongeveer driekwart van de gevallen erft de aandoening autosomaal dominant over.1 De prevalentie bij de Noordeuropese bevolking is hoger dan 1:5000.1 Hereditaire sferocytose wordt veroorzaakt door een gestoorde verankering van de plasmamembraan aan het onderliggende netwerk van eiwitten.2 Dit leidt tot uitstulping en afsnoering van kleine stukjes membraan. Omdat de ratio oppervlakte:inhoud daardoor kleiner wordt, kan de biconcave vorm van de erytrocyt niet behouden blijven en ontstaan bolvormige cellen (sferocyten). Hereditaire sferocytose ontstaat meestal door mutaties in spectrine of ankyrine,3 in zeldzame gevallen door afwijkingen in proteïne 4.24 of in het zogenaamde band 3-eiwit.5 Dit leidt bijna altijd tot een verlaagd gehalte aan spectrine in de erytrocyten. De mate van verlaging zou correleren met de ernst van de aandoening.67

Hereditaire elliptocytose

Hereditaire elliptocytose komt in de Noordeuropese bevolking minder vaak voor dan hereditaire sferocytose.8 Klinisch geef- hereditaire elliptocytose een zeer heterogeen beeld; meestal is er een lichte anemie. Ook hierbij geschiedt overerving in de meeste gevallen autosomaal dominant.9 De oorzaak is een verminderde dimeer-tetrameerbinding van spectrine of een slechte spectrinekoppeling aan band 4.1-eiwit of aan actine. Het spectrinemolecuul is gemuteerd, maar komt in een normale hoeveelheid voor. Er zijn echter zeldzame vormen die gepaard gaan met een verlaagd gehalte aan erytrocytair spectrine.10

Hereditaire pyropoikilocytose

Hereditaire pyropoikilocytose is zeldzaam en leidt meestal tot ernstige anemie. De erytrocyten worden gekenmerkt door sterke morfologische vervorming. Overerving geschiedt autosomaal recessief. Het is geen ziekte die wordt veroorzaakt door één kenmerkend genetisch defect: het lijkt een ernstige vorm van hereditaire elliptocytose. Het fenotype ‘hereditaire pyropoikilocytose’ ontstaat wanneer twee allelen, die elk op zich geen, of een zeer milde vorm van hereditaire elliptocytose veroorzaken, samen worden overgeërfd. Bij deze homozygote vormen van hereditaire elliptocytose of bij combinaties van hereditaire elliptocytose met hereditaire sferocytose worden sterk vervormde, hitte-instabiele erytrocyten aangetroffen. Meestal is er dus een dubbele heterozygotie voor hereditaire sferocytose en elliptocytose,11 of een homozygotie voor hereditaire elliptocytose.12 Meestal gaat hereditaire pyropoikilocytose gepaard met een verlaagd gehalte aan spectrine in de erytrocyten.13

Diagnostiek van hereditaire sferocytose

Door het ontbreken van familiegegevens en door de wisselende ernst van de anemie is het vooral bij patiënten met hereditaire sferocytose vaak moeilijk om een juiste diagnose te stellen. Bij deze aandoening zijn de erytrocyten licht microcytair, soms zijn sferocyten zichtbaar en meestal is de osmotische resistentie verlaagd. Geen van deze graadmeters is werkelijk specifiek voor hereditaire sferocytose. Verlaagde waarden voor osmotische resistentie van de erytrocyten worden namelijk ook gevonden bij zwangeren, bij dialysepatiënten, bij chronische leukemie en bij ijzergebreksanemie. Als bij hereditaire sferocytose sprake is van veel jonge erytrocyten met nog relatief weinig membraanverlies, kan de uitslag van een osmotische resistentietest zelfs binnen normale grenzen vallen.14

Vele behandelend artsen hebben deze problemen onderkend en hebben geprobeerd specifiekere tests te ontwikkelen. Een aantal daarvan is afgeleid van de klassieke osmotische-resistentietest,1516 of maakt gebruik van flowcytometrieapparatuur om sferocyten aan te tonen.17 De verbeteringen betreffen met name de sensitiviteit. Voor het verhogen van de specificiteit kan men beter een variabele bepalen met een directe relatie met het moleculaire defect. Spectrine is voor dit doel geschikt. Volgens de literatuur is de hoeveelheid erytrocytair spectrine bij de meeste patiënten met hereditaire sferocytose verlaagd.5-7 Bovendien is ook bij hereditaire pyropoikilocytose en in een enkel geval bij hereditiare elliptocytose de hoeveelheid spectrine in de erytrocyten verlaagd.

Kwantificering van spectrine ten opzichte van andere membraaneiwitten kan misleidend zijn, omdat ook de concentratie van die componenten verminderd kan zijn bij hereditaire sferocytose.18 Wij hebben gekozen voor een immunologische kwantificering van spectrine per erytrocyt. Hiervoor werden antistoffen opgewekt tegen humaan spectrine, waarmee een ‘radio-immuno-assay’ (RIA) werd ontwikkeld. Om de specificiteit en de sensitiviteit te testen werd het spectrinegehalte gemeten bij een aantal patiënten met verschillende erytrocytaire afwijkingen.

Materiaal en methoden

Humaan spectrine werd geïsoleerd zoals beschreven door Zail en Coetzer.19 Erytrocytenmembranen werden gewassen en het membraangebonden spectrine werd geëxtraheerd met behulp van ethyleendiamino-tetra-acetaat (EDTA) in een buffer met lage ionsterkte. Dimeren van spectrine werden met gelfiltratie gezuiverd.

Polyklonale antistoffen tegen humaan spectrine werden opgewekt bij een konijn. Het antiserum werd getest zoals aangegeven in figuur 2. Zuivering van de antistoffen vond plaats door middel van affiniteitschromatografie over geïmmobiliseerd spectrine en elutie bij lage pH. Radioactieve labeling met ¹²⁵I van de antistoffen vond plaats zoals beschreven door Hunter en Greenwood.20

Zuivere erytrocyten, verkregen door de cellen driemaal te wassen in een fysiologische zoutoplossing, werden geteld met een elektronische celteller. Op basis van deze celtelling werd een verdunningsreeks van 5 x 10⁴ tot 50 x 10⁴ erytrocyten per ml gemaakt in een gebufferde fysiologische zoutoplossing waaraan detergentia waren toegevoegd zodat de erytrocyten lyseerden. Op deze wijze werd een goed gedefinieerd erytrocytenlysaat in verschillende verdunningen verkregen.

‘Dot-blotting’ van de erytrocyteneiwitten vond plaats op nitrocellulosemembranen. Van elk monster werd een reeks van 8 verdunningen, corresponderend met 0-50 x 10³ erytrocyten, in drievoud als een druppeltje (‘dot’) op een blotmembraan gebracht. Na binding van het erytrocytenlysaat werd de blot gedurende 1 h verzadigd met een neutrale oplossing van 1 (gewichtvolume; wv) caseïne.

Incubatie van de blot met antistoffen tegen spectrine vond minimaal gedurende 2 h plaats, met per blot 5 ml ¹²⁵I-gelabeld anti-spectrine in 1 (wv) caseïne. Per blot werden circa 50.000 ‘counts per minute’ (cpm) aan radioactiviteit toegevoegd. De vrije (niet aan de blot gebonden) en de aspecifiek gebonden antistoffen werden verwijderd door middel van drie wasstappen met de 1 (wv)-caseïne-oplossing.

Telling van de gebonden radioactiviteit vond plaats door elke dot afzonderlijk uit te stansen, op te vangen in een reageerbuisje en de gebonden radioactiviteit te bepalen in een ¹²⁵I-teller.

Resultaten

Specificiteit van de tegen spectrine gerichte antistoffen

Figuur 2 laat zien dat de antistoffen die voor de kwantificering van spectrine werden gebruikt voornamelijk banden van 220 en 240 kDa herkenden; dit komt overeen met de schijnbare molecuulmassa's van respectievelijk de ?– en de ?-keten van spectrine. Dot-blots van plasma-eiwitten of van een leukocytenlysaat, beide in hoeveelheden 10 keer zo groot als maximaal bereikt kunnen worden in een normale testopzet, lieten geen verhoging van de achtergrondbinding zien, dus de binding was specifiek.

Variatie in het spectrinegehalte van erytrocyten van gezonde donors

Het verband tussen het aantal erytrocyten en de gemeten radioactiviteit was lineair tot 500 x 10³ cellen per dot. Verdunningen van zuiver spectrine gaven ook een lineaire correlatie te zien met de gebonden radioactiviteit. De hoeveelheid antigene determinanten in het gezuiverde spectrinepreparaat liep, zelfs als het ingevroren werd bewaard, terug in de tijd. Dit maakte het preparaat ongeschikt als standaard bij de metingen. Dit verouderingsproces werd overigens ook waargenomen bij ingevroren erytrocytenextracten.

Uit een experiment waarbij de hoeveelheid spectrine in erytrocyten van 12 verschillende donors (gezonde laboratoriummedewerkers) werd vergeleken, bleek dat de interdonorvariatie klein was. De hoeveelheid spectrine werd hierbij uitgedrukt als de hoeveelheid gebonden radioactiviteit per erytrocyt. De standaardafwijking in deze groep van 12 donors bedroeg 6,8. Wanneer een zelfde donor 11 keer binnen één test werd gemeten, was de standaardafwijking slechts weinig kleiner, namelijk 6,3. De gemeten variatie werd dus voornamelijk veroorzaakt door de techniek van de meting. Aangenomen werd daarom dat de hoeveelheid spectrine per erytrocyt relatief constant is. Waarden lager dan 86 (een afwijking van ruim 2 keer de standaardafwijking) van de waarde verkregen met erytrocyten van gezonde donors op dezelfde blot werden afwijkend genoemd (figuur 3).

Vers afgenomen erytrocyten en gewassen erytrocyten die 7 dagen waren bewaard bij 4°C gaven hetzelfde resultaat. Wanneer bij een patiënt met hereditaire sferocytose op verschillende dagen bloed werd afgenomen, werd in deze onafhankelijk van elkaar geteste monsters globaal een zelfde procentuele verlaging van het erytrocytair spectrinegehalte gemeten (tabel).

Spectrinebepaling bij patiënten met klinisch gediagnostiseerde hereditaire sferocytose

In een groep van 64 patiënten met klinisch gediagnostiseerde hereditaire sferocytose, afkomstig uit 52 niet-verwante families, werd het spectrinegehalte vergeleken met dat van gezonde donors (figuur 4). De diagnose werd gesteld op basis van congenitale, vaak familiaire anemie, gekenmerkt door een verlaagde osmotische resistentie of een afwijkende uitslag van de ‘acidified glycerol lysis test’ (AGLT),16 een verhoogd aantal reticulocyten, soms splenomegalie en aanvallen van geelzucht. Sferocyten waren bij veel patiënten niet zichtbaar. Bij een enkele patiënt werden combinaties van sferocyten en elliptocyten gezien. Bij 56 van de 64 onderzochte individuen (88) werd een spectrinegehalte gevonden dat lager was dan 86 van de referentiewaarde van een gezonde bloeddonor gemeten in dezelfde test. Van 52 niet-verwante patiënten met hereditaire sferocytose bleek bij 48 (92) een significant verlaagd gehalte erytrocytair spectrine voor te komen.

Bij degenen met een verlaagd gehalte waren 10 patiënten bij wie de milt was verwijderd. Een verlaagde erytrocytaire spectrinewaarde werd ook gemeten bij een 7 dagen oude baby van een moeder met hereditaire sferocytose.

Spectrinebepaling bij patiënten met een ongedefinieerde anemie bij wie een verlaagde erytrocytaire osmotische resistentie werd gemeten

Bij een groep patiënten met een verlaagde osmotische resistentie van de erytrocyten, afkomstig uit de reguliere diagnostiek voor hemolytische anemie, werd eveneens het gehalte erytrocytair spectrine bepaald. Figuur 4 (onderdeel D) laat zien dat het spectrinegehalte in deze groep een grote spreiding vertoonde. In het merendeel van de monsters met een normaal spectrinegehalte waren geen antistoffen tegen erytrocyten aantoonbaar met behulp van de directe Coombs-test. Ook in de monsters met een verlaagd spectrinegehalte werden geen antistoffen tegen erytrocyten aangetroffen.

Spectrinegehalte bij diverse erytrocytaire afwijkingen en bij zeer jonge kinderen

Ook bij een aantal patiënten met gedefinieerde erytrocytaire afwijkingen of met een erytrocytair bloedbeeld dat afweek van dat van gezonde volwassenen werd het spectrinegehalte in de erytrocyten bepaald. Uit de tabel blijkt dat afwijkende hemoglobinen niet leidden tot een verandering van het spectrinegehalte. Alleen bij een patiënt met homozygote sikkelcelanemie werd een hoger gehalte gemeten (zie figuur 3). Waarschijnlijk gaat het hier om een schijnbare verhoging van spectrine, omdat bij de elektronische telling de celconcentratie kan worden onderschat als aggregaten van sikkelcellen optreden. Erytrocyten van een pasgeboren baby met vooral foetaal hemoglobine bevatten evenveel spectrine per cel als bij volwassenen werd gemeten. Ook bij heterozygote vormen van ?-thalassemie was de hoeveelheid spectrine per erytrocyt normaal. Deficiëntie van glucose-6-fosfaatdehydrogenase of aanwezigheid van auto-antistoffen tegen erytrocyten (resulterend in een positieve Coombs-testuitslag) had evenmin invloed op het spectrinegehalte.

Beschouwing

Het grootste deel van de patiënten met hereditaire sferocytose of met hereditaire pyropoikilocytose en een klein deel van de patiënten met hereditiare elliptocytose heeft volgens de literatuurbeschrijvingen een partiële deficiëntie in erytrocytair spectrine. Om deze membraanstructuurdefecten en in het bijzonder het defect dat sferocytose veroorzaakt te kunnen diagnostiseren, ontwikkelden wij een RIA voor humaan spectrine. Bij een groep patiënten met klinisch gediagnostiseerde hereditaire sferocytose, met als minimum-voorwaarde een gestoorde osmotische resistentie of een afwijkende AGLT-uitslag en een familiaire anemie, werd met deze test in circa 90 van de gevallen een verlaagd spectrinegehalte gemeten. Bij een groep anemische patiënten met een verlaagde osmotische resistentie van de erytrocyten, van wie verder geen gegevens beschikbaar waren, werd slechts bij 33 een verlaagd gehalte aan erytrocytair spectrine gemeten. Dit verschil duidt op het voorkomen van fout-positieve uitslagen bij de bepaling van de osmotische resistentie als enig diagnosticum voor hereditaire sferocytose. Het omgekeerde, een fout-negatieve uitslag bij individuen met een normale osmotische resistentie en een verlaagd spectrinegehalte, wordt ook waargenomen,7 maar niet in ons onderzoek, omdat bij ons een gestoorde osmotische resistentie één van de selectiecriteria voor de onderzochte groep was. Een nulmale osmotische resistentie kan voorkomen bij die gevallen van hereditaire sferocytose waarbij de anemie sterk wordt gecompenseerd door aanmaak van jonge erytrocyten met een relatief normale oppervlakte-inhoudratio, of bij combinaties van hereditaire sferocytose met heterozygote ?-thalassemie. Deze laatstgenoemde afwijking heeft een tegengesteld effect op de osmotische stabiliteit van de erytrocyten. Het nettoresultaat kan een ongestoorde osmotische resistentie zijn.

In de erytrocyten van een pasgeboren baby van een moeder met hereditaire sferocytose werd door ons een verlaagd spectrinegehalte aangetoond. Meting van de osmotische resistentie op zeer jonge leeftijd geeft geen uitsluitsel, omdat bij pasgeboren patiënten met heredilaire sferocytose dit structuurdefect kan worden gemaskeerd door de verhoogde osmotische resistentie die altijd bij pasgeborenen wordt gevonden.

De hier besproken RIA voor de bepaling van spectrine in erytrocyten is specifiek voor de meeste vormen van hereditaire sferocytose, namelijk voor die gevallen waarbij de hoeveelheid spectrine is verlaagd. In de literatuur beschrijft men één moleculaire oorzaak van hereditaire sferocytose die niet leidt tot verlaging van het spectrinegehalte, namelijk mutaties in band 3-eiwit. Ongeveer 10 van de patiënten met hereditaire sferocytose heeft een normaal gehalte aan erytrocytair spectrine.5 Onze bevindingen zijn in overeenstemming met deze gegevens. In ons onderzoek werd bij 8 patiënten afkomstig uit 6 families een normaal spectrinegehalte gevonden. In al deze gevallen ging het om een lichte erfelijke anemie, gekenmerkt door een gestoorde osmotische resistentie of AGLT-uitslag van de erytrocyten. In geen van deze gevallen werden sferocyten waargenomen. Mutaties in band 3-eiwit werden niet bepaald en ook erytrocytaire enzymdeficiënties werden niet bij al deze patiënten uitgesloten.

In de literatuur wordt een direct verband gelegd tussen de hoeveelheid spectrine in de erytrocyten en de ernst van het klinische beeld. Bij het onderzoek van Agre et al. betreft het slechts een klein aantal gevallen.6 Onderzoek van Eber et al. laat zien dat alleen wanneer groepen van patiënten met hereditaire sferocytose van verschillende klinische ernst met elkaar worden vergeleken, de gemiddelde hoeveelheid erytrocytair spectrine van de ene groep significant afwijkt van de gemiddelde waarde gevonden bij een andere groep.7 De groep met een lichte vorm van hereditaire sferocytose kon op deze wijze niet worden onderscheiden van de groep gezonde donors. Interpretatie van een individuele meting bij een patiënt werd bemoeilijkt door de grote spreiding in uitslagen van de in dat laboratorium gebruikte bepaling van spectrine.

Een andere factor die een eventuele correlatie tussen het spectrinegehalte en de ernst van het ziektebeeld kan beïnvloeden, is de variatie in moleculaire defecten die tot hereditaire sferocytose kunnen leiden. Ook het gehalte aan andere structuureiwitten kan namelijk een rol spelen bij het handhaven van de celstructuur. De voorlopige indruk uit ons onderzoek is dat een zeer laag spectrinegehalte altijd correleert met een ernstig klinisch beeld. Bij de relatief geringere verlagingen was het klinische beeld wisselend. Enige voorzichtigheid bij de interpretatie van de mate van verlaging van het spectrinegehalte is dus geboden.

Conclusie

De radio-immunologische bepaling van spectrine in erytrocyten betekent een aanzienlijke vooruitgang in de diagnostiek van hereditaire sferocytose. Bij patiënten bij wie op klinische gronden hereditaire sferocytose wordt vermoed, maar bij wie de osmotische resistentie normaal lijkt, kan meestal door de bepaling van spectrine in de erytrocyten toch een diagnose worden gesteld. Indien bij patiënten bij wie hereditaire sferocytose wordt vermoed een verlaagde osmotische resistentie van de erytrocyten wordt gevonden bij een negatieve Coombs-testuitslag en een normaal spectrinegehalte, dient eerst een eventuele erytrocytaire enzymdeficiëntie of een hemoglobinopathie te worden uitgesloten alvorens het beeld benoemd mag worden als hereditaire sferocytose.