Van gen naar ziekte; 'frame shift'-mutatie in het CARD15-gen en de ziekte van Crohn

Inleiding

de ziekte

De ziekte van Crohn is een chronische inflammatoire darmziekte. De incidentie in Nederland is 4-8 gevallen per 100.000 inwoners per jaar. De prevalentie ligt rond de 0,5.1-3 De ziekte van Crohn wordt gekenmerkt door een chronische of terugkerende transmurale granulomateuze ontsteking van het maag-darmkanaal. De gehele tractus van mond tot anus kan bij de ziekte betrokken zijn. De meest voorkomende lokalisatie is het ileocoecale gebied (40). Een typisch endoscopisch beeld is weergegeven in figuur 1. De ziekte van Crohn kan gecompliceerd worden door stenosering en door fisteling, zoals perianale en entero-enterale fistels. Daarnaast kan de ziekte zich buiten het maag-darmkanaal manifesteren, onder andere in de vorm van artritis, erythema nodosum, pyoderma gangraenosum of uveïtis.4

Hoewel de oorzaak van de ziekte van Crohn onbekend is, zijn er sterke epidemiologische aanwijzingen voor een genetische predispositie. De ziekte komt met name voor bij blanken en in het bijzonder bij asjkenazim-joden.5 4 tot 18 van de patiënten met de ziekte van Crohn heeft een eerstegraadsfamilielid met een chronische inflammatoire darmziekte.6 Bij tweelingonderzoek blijkt de concordantie voor de ziekte van Crohn bij monozygote tweelingen 42-58 te zijn en slechts 0-12 bij dizygote tweelingen.7 8 Hoge concordantiecijfers voor de ziekte worden ook gevonden binnen families met twee of meer aangedane bloedverwanten.6 9

Niet-genetische factoren spelen evenzo een rol bij het ontstaan van de ziekte van Crohn. Zo is in verschillende diermodellen aangetoond dat een chronische inflammatoire darmziekte alleen ontstaat bij de aanwezigheid van bacteriële flora en niet onder kiemvrije omstandigheden. Bij patiënten met een Crohn-colitis of ernstige perianale fistels kan deviatie van de fecale stroom door een ontlastend ileo- of colostoma leiden tot klinische verbetering. Tot slot, in sommige gevallen leidt behandeling met antibiotica tot afname van de ziekteactiviteit.10

het gen

Tijdens de jaren negentig van de vorige eeuw hebben meerdere onderzoeksgroepen gezocht naar genen die een rol zouden kunnen spelen in de pathogenese van de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Laatstgenoemde ziekte is de tweede belangrijke chronische inflammatoire darmziekte.11 Koppelingsonderzoek bij families met meerdere personen die zijn aangedaan met een chronische inflammatoire darmziekte heeft geresulteerd in een aantal chronisch inflammatoire, aan darmziekte gerelateerde chromosomale gebieden (tabel 1). De resultaten pleiten sterk voor een multigenetische oorsprong van zowel de ziekte van Crohn als colitis ulcerosa.19

Het best gedocumenteerde locus ligt rond de centromeer van chromosoom 16 (16q12). Dit zogenaamde inflammatoire-darmziekte(IBD)-1-locus is gekoppeld aan de ziekte van Crohn.12 20 Vorig jaar hebben twee groepen onafhankelijk van elkaar aangetoond dat deze koppeling berust op DNA-variaties in het ‘caspase recruitment’-domein(CARD)-15-gen (tot voor kort ‘nucleotidebindend oligomerisatiedomein(NOD)-2-gen’ genaamd).21 22 In dit gen zijn tot op heden 67 enkelvoudige nucleotideveranderingen ontdekt.23 Slechts 3 daarvan bleken onafhankelijk significant samen te hangen met de ziekte van Crohn in bevolkingsgroepen in de Verenigde Staten, Canada en Europa; 2104C>T in exon 4 (Arg702Trp), 2722G>C in exon 8 (Gly908Arg) en 3020insC in exon 11 (Leu1007fsinsC).21 23 Hoewel alledrie nucleotideveranderingen als mutaties worden beschouwd, is alleen van de laatstgenoemde een functioneel defect in vitro aangetoond.22 Deze ‘frame shift’-mutatie betreft een cytosine-insertie op positie 3020 van exon 11. Dit leidt tot de substitutie van een leucine door een proline op aminozuurpositie 1007 en bovendien tot een stopcodon waardoor het CARD15-eiwit korter wordt. Deze frame-shiftmutatie is gelokaliseerd in het distale deel van het gen dat codeert voor de staart van het eiwit, het zogenaamde C-terminale ‘leucine-rich repeats’(LRR)-gedeelte.21 22 24

het eiwit

Het CARD15-eiwit bestaat uit 1040 aminozuren en heeft qua structuur veel overeenkomsten met het reeds bekende CARD4-eiwit (of NOD1-eiwit). CARD15 heeft twee caspase-recruitmentdomeinen (CARD1 en 2) aan de N-terminale kant, een nucleotidebindend domein in het midden en een LRR-gebied aan het C-terminale einde.24 Het eiwit is schematisch weergegeven in figuur 2, met gemarkeerd de drie met de ziekte van Crohn samenhangende aminozuurveranderingen. Het CARD-domein kan interacties aangaan met CARD-structuren in andere cytoplasmatische eiwitten, waaronder procaspasen.25 Het nucleotidebindend domein is in staat ATP en guanosinetrifosfaat te binden en is waarschijnlijk betrokken bij oligomerisatie van eiwitmoleculen.26 27 LRR's komen voor in eiwitten die betrokken zijn bij herkenning van pathogenen. In dit kader is het CARD15-eiwit mogelijk een receptor van bacteriële producten, waaronder endotoxine (een lipopolysacharide, een celwandcomponent van gramnegatieve bacteriën).24

De functie van CARD15 is nog niet volledig opgehelderd. In-vitro-experimenten met CARD15-‘copy’-DNA-getransfecteerde embryonale niercellen (HEK293T) hebben aangetoond dat expressie van het CARD15-eiwit leidt tot activatie van de caspasecascade via het N-terminale CARD-domein en daarmee tot apoptose (geprogrammeerde celdood) (figuur 3). Apoptose zorgt voor een normale ontwikkeling en homeostase van weefsels en organen. Door binding met procaspase-9, wordt het inactieve procaspase-9 omgezet in actief caspase-9.24 25 Expressie van CARD15 in HEK293T-cellen leidt ook tot activatie van nucleaire factor kappa-B (NF-?B). NF-?B is de naam voor een groep van eiwitten die een belangrijke rol spelen als regulator van genen van proïnflammatoire cytokinen, adhesiemoleculen, chemokinen, groeifactoren, cyclo-oxygenase-2 en induceerbare stikstofsynthetase. NF-?B bevindt zich als inactief dimeer in het cytoplasma. Activatie van NF-?B gaat via RICK (‘RIP-like interacting CLARP kinase’ (RIP = ‘receptor-interacting protein’; CLARP = ‘caspase-like apoptosis regulatory protein’)), een CARD-bevattend kinase dat een complex vormt met het CARD-domein van het CARD15-eiwit. Het LRR-domein lijkt een rol te spelen bij de herkenning van pathogenen en de inductie van een pathogeenspecifieke respons. In geval van CARD15 is gesuggereerd dat dit domein fungeert als een intracellulaire receptor voor lipopolysacharide. Na binding (of interactie) van intracellulair lipopolysacharide met het LRR-domein wordt NF-?B geactiveerd, dat vervolgens migreert van het cytoplasma naar de celkern om specifieke genen tot expressie te brengen.24 28

De CARD15-frame-shiftmutatie leidt tot verkorting van het LRR-domein met 33 aminozuren. De met deze mutatie getransfecteerde HEK293T-cellen blijken een verlaagde NF-?B-activatie te hebben.22 Bij patiënten met de ziekte van Crohn blijkt de expressie van NF-?B in colonslijmvlies daarentegen juist hoger dan in het colon van gezonde personen.29 Derhalve is de exacte rol van de CARD15-frame-shiftmutatie bij het ontstaan van de ziekte van Crohn vooralsnog onduidelijk, gelet op de discrepantie tussen experimentele en klinische bevindingen. In dit kader is het interessant op te merken dat, terwijl NF-?B vaak als een proïnflammatoire factor wordt beschouwd, NF-?B-deficiënte muizen een spontane colitis ontwikkelen.30 Op dit moment bestaan er enkele hypothesen. Door een veranderde (verminderde) herkenning van bacteriële micro-organismen zou een ontregelde inflammatoire respons kunnen ontstaan. Daarnaast zou het gemuteerde CARD15 kunnen leiden tot een inadequate anti-inflammatoire respons via bijvoorbeeld interleukine-10.22 Ook zou de mutatie kunnen leiden tot een verlaagd apoptotisch signaal en daarmee tot een ontregeling van het ontstekingsproces.

de cel

Het CARD15-eiwit komt tot expressie in monocyten24 en mogelijk ook in enterocyten.31 Monocyten zijn betrokken bij de niet-specifieke cellulaire immuniteit. Het zijn voorlopers van weefselgebonden cellen, waaronder intestinale macrofagen en dendritische cellen. Deze antigeenpresenterende cellen spelen een centrale rol bij het initiëren van een immuurespons na binding met specifieke enterale antigenen. De abnormale inflammatoire respons bij de ziekte van Crohn berust op een ontregelde T-helper-1-respons, gekenmerkt door de vrijmaking van proïnflammatoire cytokinen, zoals tumornecrosisfactor-? en interferon-?.32 Of CARD15 ook tot expressie komt in de intestinale antigeenpresenterende cellen lijkt erg aannemelijk, maar is vooralsnog niet beschreven.

de populatie

De frequentie van vóórkomen van de CARD15-frame-shiftmutatie bij patiënten met de ziekte van Crohn is 11-19 in de heterozygote vorm en 3-7 in de homozygote vorm. Bij patiënten met colitis ulcerosa en controlepersonen is alleen de heterozygote vorm gevonden in 6-9 van de gevallen.21 22 De frequentie van vóórkomen bij sporadische patiënten en patiënten met een positieve familieanamnese blijkt niet verschillend.23 33 34

Dragerschap betekent een verhoogd risico op het krijgen van de ziekte van Crohn. Terwijl voor heterozygoten het risico 2-3 maal verhoogd is, gaat homozygoot dragerschap gepaard met een 17-42 maal verhoogd relatief risico.21 22 33 Deze berekeningen zijn gebaseerd op de oorspronkelijke publicaties waarbij gezonde homozygote dragers ontbraken. In onze eigen populatie troffen wij echter wel homozygote dragers aan die tot op hoge leeftijd geen ziekte van Crohn hadden gekregen.

Naast de frame-shiftmutatie gaat dragerschap van de twee beschreven mutaties in exon 4 en 8 ook gepaard met een verhoogd ziekterisico. Opvallend genoeg komt geen van de drie nucleotideveranderingen tezamen voor op hetzelfde allel. In tabel 2 staat een risicoberekening gemaakt voor het ontstaan van de ziekte van Crohn in geval van dragerschap van één of twee van deze DNA-veranderingen.21 Het bevolkingsattributief risico van de gevonden mutaties in CARD15, oftewel het verminderde risico op het krijgen van de ziekte van Crohn bij afwezigheid van de drie mutaties in de bevolking, wordt geschat op 15-20.35

diagnostiek

De diagnose ‘ziekte van Crohn’ wordt gesteld op grond van klinische, radiologische en endoscopische criteria. CARD15-DNA-diagnostiek bij de ziekte van Crohn heeft tot dusver geen consequenties ten aanzien van diagnostiek en behandeling. Ook kan de huidige kennis (nog) niet gebruikt worden als een non-invasieve screening bij vermoeden van het bestaan van de ziekte van Crohn. Daarentegen laat recent onderzoek wel zien dat dragerschap van de CARD15-frame-shiftmutatie bij Crohn-patiënten samenhangt met een vroege start van de ziekte,36 lokalisatie van ziekte in het ileum34 36-39 en een stenoserend ziektebeloop.36 38 39 Over de samenhang met fistels bestaan tegengestelde berichten.36 38 Met deze kennis is subtypering mogelijk en kan met enige voorzichtigheid iets over het beloop en de prognose worden gezegd.

conclusie

De ontdekking van het CARD15-gen is een mijlpaal op het gebied van inflammatoire darmziekten, die nieuwe inzichten zal werpen op de pathogenese van de ziekte van Crohn. Echter, de belangrijkste conclusie is misschien wel dat de ziekte van Crohn een genetisch complexe aandoening is, waarbij een enkele risicofactor noch noodzakelijk noch voldoende is om de ziekte te doen ontstaan.

Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld.