Nieuwe inzichten en hypothesen ten aanzien van de bloedstolling in vivo

Het mechanisme van de bloedstolling vormt ongetwijfeld een van de minst populaire onderdelen van de medische studie. Dat is te wijten aan de veelheid van betrokken eiwitten, cellen en andere elementen en de onlogische opbouw door het ontbreken van een duidelijke functionele betekenis van het bestaan van twee gescheiden systemen (het intrinsieke en extrinsieke systeem) met hetzelfde doel: fibrinevorming. Voorts dragen de verschillende mechanismen die de stolling tegengaan, zoals het fibrinolytisch systeem en de proteïnen C en S, niet bij tot een snel begrip van het stollingsproces. In de afgelopen jaren is in de internationale literatuur relatief veel aandacht geschonken aan de belangrijke rol van bloedplaatjes bij het ontstaan van vooral arteriële trombose, en aan de rol van de fibrinolyse, vanwege de therapeutische mogelijkheden met fibrinolytica. De bijdrage van het stollingssysteem in het plasma (het systeem gevormd door de op elkaar ingrijpende stollingsfactoren) aan het ontstaan van trombose en atherosclerose en ook de vele interacties met bloedplaatjes en fibrinolyse hebben aanvankelijk betrekkelijk weinig aandacht gekregen, maar zijn recentelijk weer meer in de belangstelling gekomen. Daarnaast beginnen de inzichten in het functioneren van de bloedstolling in vivo ingrijpende veranderingen te ondergaan.

In het navolgende willen wij de nieuwe inzichten in het mechanisme en de functie van het stollingssysteem beschrijven aan de hand van recente onderzoeken bij de mens en dierexperimentele studies.

Het klassieke model van het stollingssysteem

Volgens de inmiddels klassieke indeling bestond het stollingssysteem uit twee gescheiden wegen, het intrinsieke en het extrinsieke deel, samenkomend bij factor X, om ten slotte gemeenschappelijk tot de vorming van fibrine te leiden (figuur 1). In aansluiting op adhesie, aggregatie en secretie van bloedplaatjes, de eerstelijnsverdediging bij vaatwandbeschadiging, wordt het stollingssysteem in plasma ingeschakeld. De intrinsieke stolling werd geacht geactiveerd te worden door interactie van de betrokken stollingseiwitten met negatief geladen moleculen, bijvoorbeeld subendotheliaal collageen dat met bloed in contact komt na beschadiging van de intima. Via een gecompliceerde interactie met (pre)kallikreïne, hoogmoleculair kininogeen en factor XII (deze eiwitten worden samen ook wel het contactsysteem genoemd) kan hieruit via activering van de factoren XII en XI en de factoren IX en VIII uiteindelijk factor X worden geactiveerd.

De extrinsieke route start met contact tussen factor VII en de extrinsieke ‘cofactor’ weefselfactor (als vertaling van de thans internationaal gebruikte term ‘tissue factor’). Na complexvorming wordt vervolgens in één stap factor X geactiveerd. Het laatste, gemeenschappelijke gedeelte omvat de activering van factor X, waarna de gevormde factor Xa weer protrombine in trombine omzet. Trombine katalyseert de vorming van fibrine uit fibrinogeen, waarna de fibrinemonomeren gepolymeriseerd worden onder invloed van factor XIIIa (ontstaan uit factor XIII onder invloed van trombine).

De factoren die een remmend effect op stollingsactivering hebben, worden ter wille van de duidelijkheid slechts summier aangeduid. Allereerst zullen nu de principes van stollingsactivering en de lokalisatie van deze reacties besproken worden.

Mechanismen van de bloedstolling in vivo

De plasmatische stolling bestaat uit een serie enzymatische reacties, waarbij een precursoreiwit of zymogeen door een reeds geactiveerd eiwit (enzym) wordt gebonden via een actief centrum dat het aminozuur serine bevat. Deze enzymen worden ook wel aangeduid als serineproteasen. Bij deze interacties verandert de conformatie van het zymogeen zodanig dat het zelf enzymatisch actief wordt en een volgende factor kan activeren door hierin een peptideband te splitsen. Voor een optimale activering van verschillende factoren zijn verder de aanwezigheid van calciumionen en een geschikt fosfolipidenoppervlak noodzakelijk.

De genoemde interacties zijn in detail bestudeerd voor stollingsfactoren en bloedplaatjes, en ook met synthetische fosfolipidenmengsels. Als voorbeelden hiervan gelden het complex van tenase (factor IXa, VIIIa, calcium, fosfolipiden) en dat van protrombinase (factor Xa, Va, calcium, fosfolipiden).1 In optimale omstandigheden verloopt de stolling als een ‘cascade’ (letterlijk ‘waterval’), waarbij elke stap de omzettingssnelheid van de volgende reactie met een veelvoud doet toenemen.2 Daardoor kan binnen fracties van seconden de fibrinevorming voltooid worden, mits de stimuli- en reactieomstandigheden gunstig zijn. Hoewel de meeste reacties verlopen in de richting van de omzetting van fibrinogeen in fibrine, kent het stollingssysteem een aantal belangrijke terugkoppelingsreacties, waarvan de activering van de cofactoren V en VIII door trombine een van de voornaamste is.3 Deze omzetting veroorzaakt een verdere versterking van de trombinevorming, en daarmee ook van de fibrinevorming. Voor een verdere bespreking van deze mechanismen wordt verwezen naar een recent overzichtsartikel.4

Teneinde een indruk te krijgen van het werkingsmechanisme van de stolling zijn verschillende methoden ontwikkeld waarmee de vorming van enzymen gemeten kan worden. De eenvoudigste bepalingen zijn die waarbij met behulp van zogenaamde chromogene substraten de activiteit van geactiveerde factoren wordt gemeten. Kwantificering van vrije stollingsenzymen in plasma is echter gezien de diverse interacties hiervan met andere eiwitten en in het bijzonder de stollingsremmers vrijwel onmogelijk. Wel is het mogelijk om complexen van enzymen en hun specifieke remmers te kwantificeren, zoals voor het trombine-antitrombine-III-complex met commerciële ELISA's is aangetoond.56 Ook voor de fibrinolyse zijn dergelijke bepalingen ontwikkeld, zoals voor het plasmine-?₂-antiplasminecomplex.7

Een andere benadering gaat uit van het principe dat bij een aantal factoren een of meer peptiden tijdens activering worden afgesplitst, die in de circulatie vrijkomen. Deze peptiden zijn via specifieke immunologische methoden in plasma aan te tonen. Zo bestaan er radioimmunoassays voor het kwantificeren van de peptiden die worden vrijgemaakt bij de vorming van fibrine uit fibrinogeen (FPA),8 trombine uit protrombine (FI2),9 factor IXa uit factor IX (FIXP)10 en factor Xa uit factor X (FXP).11 Met dergelijke bepalingen is het mogelijk het ontstaan van enzymen in de circulatie die actief zijn in het stollingssysteem op zeer nauwkeurige wijze te volgen.

De bepaling van FPA wordt al geruime tijd klinisch gebruikt om hypercoagulabiliteit vast te stellen; thans zijn er ook commerciële bepalingen voor het protrombinefragment F12 in Nederland op de markt. Een bespreking van de indicaties voor klinische toepassing van deze methoden valt buiten het bestek van dit artikel. In het navolgende zal worden nagegaan hoe dergelijke bepalingsmethoden voor het bestuderen van de feitelijke reactiemechanismen van stolling in vivo zijn toegepast en welke de betekenis van deze studies is voor onze kennis omtrent het stollingssysteem.

Basale stollingsactivering in vivo

Toepassing van radioimmunoassays voor het meten van F12 en FPA als maat voor de vorming van trombine en fibrinemonomeren heeft aangetoond dat bij elk individu een meetbaar niveau van stollingsactivering aanwezig is.12 Dat dit basale gehalte niet het gevolg is van ‘ruis’ in de assay blijkt uit onderzoeken naar de effecten van orale anticoagulantia. Bij patiënten en bij gezonde vrijwilligers onder antistollingsbehandeling blijkt een dosisafhankelijke daling van de basale gehalten F12 en FPA op te treden.1314 Dit wijst erop dat basale activering bij normale individuen zonder antistollingsbehandeling hoogst waarschijnlijk het gevolg is van een werkelijke activering van de stolling. Recentelijk is duidelijk geworden dat deze basale activiteit ontstaat door de werking van factoren betrokken bij de extrinsieke route van de bloedstolling. Bestudering van patiënten met congenitale deficiënties van de intrinsieke factoren XI, IX en VIII liet zien, dat de gehalten F12 en FPA niet verschillen van die bij normale personen.1011 In tegenstelling hiermee bleken patiënten met een ernstige factor VII-deficiëntie een sterk verlaagde stollingsactivering te hebben, zoals gemeten met de bepalingen voor F12-fragment en FPA. Dit onderzoek bevestigde tevens de eerdere laboratoriumbevinding dat factor IX rechtstreeks door het factor VIIa-weefselfactorcomplex geactiveerd wordt. Deze directe verbindingsweg tussen extrinsiek en intrinsiek systeem – welke ook wel ‘Josso-lus’ wordt genoemd, naar een van de ontdekkers – bleek de basale factor IX-activering in vivo te veroorzaken (figuur 2).1015-17

Deze resultaten impliceren dat de basale stollingsactivering gegenereerd wordt onder invloed van het extrinsieke systeem en dat de intrinsieke weg blijkbaar niet actief is. Over de oorsprong van de extrinsieke activiteit is nog weinig bekend. Wel lijkt het aannemelijk dat deze ontstaat door complexvorming van factor VII met weefselfactor, en niet door proteolytische activiteit van de vrije factor VIIa. In recent, nog niet gepubliceerd dierexperimenteel onderzoek werd aangetoond dat de stollingsactivering geïnduceerd door intraveneuze toediening van factor VIIa volledig geneutraliseerd wordt door gelijktijdige toediening van monoklonale antistoffen die de activering van de factoren IX en X door het factor VIIa-weefselfactorcomplex remmen. Het is derhalve aannemelijk dat de celgebonden cofactor – die immunochemisch niet aantoonbaar is op normaal endotheel,1819 of op niet gestimuleerde monocyten,20 beide potentiële bronnen van weefselfactor – in niet aantoonbare hoeveelheden in staat is om de extrinsieke stolling in gang te houden. Toch kan niet worden uitgesloten dat stollingsactivering in basale omstandigheden ook op subendotheliaal niveau plaatsvindt, waar wel weefselfactor immunologisch en functioneel aantoonbaar is.21

De relevantie van een basale stollingsactiviteit ligt vermoedelijk daarin, dat indien werkelijk fibrinevorming noodzakelijk is (zoals bij vaatletsel) een ‘draaiende motor’ sneller op gang komt dan een ‘stilstaande motor’. De rustactivering is dan een vorm van ‘stationair’ draaien. Dat de basale activering niet spontaan in manifeste fibrinevorming ontaardt, is vooral het gevolg van de remmende systemen in de circulatie. Het gaat hier vooral om antitrombine III, dat via 1:1-complexvorming serineproteasen inactiveert,22 om het proteïne C- en S-mechanisme dat via proteolytische inactivering de cofactoren V en VIII uitschakelt en daarmee de intrinsieke lus blokkeert,23 en ten slotte om het weefselfactorremmersysteem.24 Dit laatste wordt gevormd door het deels aan lipoproteïnefracties, deels aan endotheel gebonden eiwit ‘weefselfactorweg-remmer’ (‘tissue factor pathway inhibitor’, TFPI). De TFPI remt het factor VIIa-weefselfactorcomplex door inhibitie van de factor X-activering, terwijl de factor IX-activering in principe niet wordt beïnvloed. Aangezien de basale stollingsactivering uitsluitend door het factor VIIa-weefselfactorcomplex wordt veroorzaakt, speelt de TFPI waarschijnlijk een belangrijke rol in de cellulaire controle van deze activering.

De in rustomstandigheden aanwezige blokkade van de intrinsieke route is vooral te danken aan het antitrombine III- en proteïne C- en S-systeem. Dit laatste blijkt uit het feit dat deficiëntie van een van deze factoren aanleiding geeft tot een toename van de trombinevorming,2526 welke althans bij de proteïne C-deficiëntie te bestrijden is door toediening van gezuiverd proteïne C.26 Dierexperimenteel blijkt dit laatste effect na te bootsen door toediening van monoklonale antistoffen tegen proteïne C aan bavianen, hetgeen resulteert in een sterke stijging van trombine-antitrombinecomplexen (F.Taylor, schriftelijke mededeling, 1992).

Wat is nu de betekenis van het intrinsieke deel van de stolling in het licht van deze bevindingen? Ten eerste lijkt het intrinsieke deel vanaf factor IX naar factor X een sleutelrol te vervullen in de regulatie van trombinevorming. De cruciale rol van de factoren IX en VIII voor een normaal functioneren blijkt uit het feit dat deficiënties hiervan leiden tot een ernstige hemorragische diathese. Wij postuleren dat de hoeveelheid trombine die beschikbaar blijft voor activering van de cofactoren V en VIII en voor bloedplaatjesactivering waarschijnlijk bepalend is voor de mate waarin de reactiesnelheden in de intrinsieke lus worden aangezwengeld. Het is mogelijk dat hierbij primair de hoeveelheid factor IXa die in rusttoestand gevormd wordt, voldoende is om katalytisch efficiënt te werken op factor X, indien het tenasecomplex gevormd kan worden. Zo zou een in fysiologische omstandigheden betrekkelijk traag werkend systeem, wanneer dit nodig is, in korte tijd een werkelijke cascade kunnen worden. Op grond van het feit dat patiënten met een ernstige deficiëntie van factor XI een sterkere bloedingsneiging kunnen hebben, althans in relatie tot trauma27 (hoewel de klinische expressie zeer variabel is en de bloedingsneiging niet samenhangt met de ernst van de deficiëntie als zodanig), is het waarschijnlijk dat de intrinsieke factor XI wel een rol speelt in de stollingsregulatie, mogelijk als extra stimulus voor de factor IX-activering aan endotheeloppervlak. In dit verband is het interessant dat factor XI weer direct door trombine kan worden geactiveerd. Deze reactie kan worden gekatalyseerd door glycosaminoglycanen uit de extracellulaire matrix.2829

Dat dit mechanisme in vivo operationeel kan zijn, wordt gesuggereerd door het feit dat bij diffuse intravasale stolling wel geactiveerde factor XI (in complex met ?₁-antitrypsine), maar nog nooit geactiveerde factor XII is aangetoond. Wij vermoeden dat het eerste deel van de intrinsieke stolling, omvattende het factor XII-kallikreïne-kininogeencomplex, vooral betrokken is bij regulatie van complement-fibrinolyse-activiteit en in de stolling als zodanig een te verwaarlozen rol speelt. De volgende argumenten spelen hierbij een rol. Ten eerste is bij factor XII-deficiënties de basale stollingsactivering intact (K.A.Bauer, schriftelijke mededeling, 1991). Ten tweede, en dit is belangrijker, is er bij congenitale ernstige deficiënties van factor XII geen sprake van een hemorragische diathese. Integendeel, ernstige deficiënties van factor XII lijken meer te predisponeren voor trombose dan voor bloedingen.30 Dit wordt vermoedelijk veroorzaakt doordat factor XII naast weefselplasminogeenactivator (tPA) en urokinase-plasminogeenactivator (uPA) een belangrijke rol vervult in de activering van plasminogeen, en derhalve van het fibrinolytisch systeem.31 Qua structuur lijkt factor XII dan ook sterk op tPA. Ten slotte lijkt de rol van het contactsysteem als onderdeel van het fibrinolytische systeem en niet als onderdeel van het stollingssysteem te worden bevestigd bij patiënten met hereditair angioneurotisch oedeem. Deze patiënten hebben een deficiëntie van de remmer van de eerste factor van het complementsysteem (Cl-esteraseremmer), die tevens de belangrijkste remmer van factor XIIa en kallikreïne is. Bij deze patiënten is tijdens aanvallen in vivo-activering van het contactsysteem aantoonbaar, waarbij wel activering van fibrinolyse (plasminegeneratie), maar geen stollingsactivering (trombinegeneratie) wordt waargenomen.32 De verwevenheid van het contactsysteem (factor XII, prekallikreïne en hoogmoleculair kininogeen) met de fibrinolyse blijkt verder nog uit het feit dat bradykinine, een fragment dat door kallikreïne uit hoogmoleculair kininogeen wordt gesplitst, onder andere tPA-afgifte uit endotheel induceert, althans bij dierlijk endotheel, en sterk vaatverwijdend werkt, wat in het geval van een lokale trombus maximale perfusie garandeert.33

Door endotoxine en tumornecrosefactor gestimuleerde stollingsactivering

Ten slotte willen wij nog kort ingaan op recent onderzoek, dat een illustratie vormt van de wijze waarop de toepassing van bepalingsmethoden voor stollingsactivering inzicht heeft gegeven in een bepaalde vorm van stollingsstimulatie in vivo. Dit betreft de effecten van endotoxine en mediatoren in de circulatie. Tijdens een endotoxinemie wordt onder andere de plasmatische stolling geactiveerd. In vitro-onderzoek en klinische onderzoeken gaven de indruk dat hier vooral een plaats voor de intrinsieke activering lag. Immers, factor XII kan direct door endotoxine worden geactiveerd en bij patiënten met sepsis is het factor XII-gehalte sterk gedaald.34 Maar bij bestudering van de effecten van endotoxine en van de belangrijkste mediator tumornecrosefactor (TNF), toegediend aan gezonde vrijwilligers, blijkt dat de meetbare stollingsactivering (in de zin van stijgende plasmaconcentraties van activeringspeptiden F12 en FPA) uitsluitend via de extrinsieke route verloopt.3536 Dat valt af te leiden uit het ontbreken van aanwijzingen voor activering van het intrinsieke systeem gemeten met gevoelige methoden voor factor XIIa-C1-inhibitor-complexen, kallikreine-C1-inhibitor-complexen en factor IX-peptide.35 Directer bewijs voor deze hypothese komt uit studies bij chimpansees, welke dieren een stollingssysteem hebben dat vrijwel identiek is met dat van de mens, waarbij specifieke antistoffen tegen het factor VII-weefselfactorcomplex de door endotoxine geïnduceerde stollingsactivering volledig neutraliseren.37 Bovendien blijkt uit zeer recent onderzoek in een sepsismodel bij bavianen dat directe blokkade van de contactactivering met anti-factor-XIIa-antistoffen niet leidt tot een vermindering van de stollingsactivering (F.Taylor, schriftelijke mededeling, 1992). Het is dus zo, dat onder experimentele condities met klinisch relevante hoeveelheden endotoxine stollingsactivering primair via het extrinsieke systeem in gang wordt gezet. Er zijn echter duidelijke aanwijzingen dat bij ernstige sepsis intrinsieke activering wel een rol speelt.38 Er zijn goede redenen om aan te nemen dat het factor XII-kininogeen-kallikreïnesysteem in samenhang met het complementsysteem vooral een rol speelt bij regulatie van het fibrinolytisch systeem, de vaatpermeabiliteit en de bloeddruk bij endotoxinemie.39

Deze voorlopige onderzoeksresultaten werpen een nieuw licht op een inmiddels klassiek concept van de functie van de plasmatische bloedstolling in vivo. Wij hopen aannemelijk te hebben gemaakt dat vooral het extrinsieke stollingsgedeelte, bestaande uit factor VII(a) en weefselfactor, een sleutelrol vervult bij de regulatie van stollingsactivering in vivo. De intrinsieke lus via factor IX en de cofactoren VIII en V kan via inschakeling van geactiveerde bloedplaatjes (of endotheelcellen) tot een belangrijke versterking van de trombinegeneratie leiden. Hierbij speelt de eerder gepostuleerde lus van Josso een belangrijke rol. Het klassieke contactsysteem, gevormd door onder meer de factoren XII, kallikreïne en kininogeen, is waarschijnlijk vooral betrokken bij de fibrinolytische activering; een rol bij de stolling in vivo is nog niet aangetoond. Figuur 3 toont een stollingsschema volgens de genoemde inzichten.

Conclusie

Wat is het klinisch belang van deze hypothesen? Wij menen dat een beter begrip van de werkelijke functie van de bloedstolling kan leiden tot meer zinvolle interventies bij trombotische complicaties. Een voorbeeld levert het genoemde onderzoek naar door endotoxine gestimuleerde stolling: aangetoond kon worden dat deze geheel berust op activering van factor VII-weefselfactorcomplex, terwijl de intrinsieke stolling, althans het allereerste gedeelte, niet actief is. Dit betekent dat voor de preventie van door endotoxine geïnduceerde intravasale stolling interventies op het niveau van factor VII-weefselfactorcomplex een zinvolle aanvulling zouden zijn op het beperkte therapeutische arsenaal dat thans beschikbaar is. Met de voortschrijdende ontwikkeling van remmende monoklonale antistoffen en synthetische peptiden is dit binnen enkele jaren mogelijk. Maar ook bij arteriële trombose (ook myocardinfarcten) speelt weefselfactor waarschijnlijk een rol, gezien het meer vóórkomen van dit eiwit op atheromateuze plaques. Naast trombocytenaggregatieremming zou anti-factor-VII-weefselfactortherapie een zinvolle adjuvante behandeling kunnen zijn.

Verder onderzoek naar de regulatie van de verschillende terugkoppelings- en versterkingsreacties is van groot belang, omdat alleen met dit onderzoek kan worden bepaald welke bevindingen uit de scala van in vitro-onderzoeksbevindingen nu werkelijk belangrijk zijn. Door selectieve interventies in klinische situaties zullen uiteindelijk de ontwikkelde hypothesen moeten worden getoetst op hun juistheid.