Foetaal DNA in maternaal bloed

Nijmegen, mei 2004,

Graag willen wij het overzicht van collega's Rijnders et al. (2004:170-4) aanvullen met enkele van onze eigen onderzoeksresultaten en aan de hand daarvan tevens enkele kanttekeningen plaatsen bij de toepasbaarheid van diagnostisch onderzoek naar vrij DNA in de kliniek.

In 1997 troffen wij in het kader van onze onderzoekslijn ‘Moleculaire tumordiagnostiek in lichaamsvloeistoffen’ in het vrij in het serum circulerende DNA van 6 van de 7 patiënten met een gemetastaseerde dikkedarmtumor (Dukes-D-stadium) dezelfde K-ras-oncogenmutaties aan als in de primaire tumor.1 Vervolgens vonden wij echter bij Dukes-B- en -C-patiënten de K-ras-mutaties van de primaire tumor niet terug in het plasma. Dit was uiteindelijk de reden dat wij de detectie van uit de tumor afkomstig DNA als marker voor vroegdiagnostiek en prognose hebben verlaten. Ook in de literatuur vinden wij na een aanvankelijke periode (1995-1999) met meerdere publicaties met positieve resultaten, hierover de laatste jaren weinig meer terug. Over de klinische toepasbaarheid van de detectie van tumorspecifiek vrij DNA in het plasma zijn wij dan ook sceptisch.

In de jaren daarna hebben wij onderzocht of behalve voor oncologische diagnostiek, vrij circulerend DNA ook van waarde kan zijn voor de prenatale diagnostiek en vroegdetectie van hypertensieve aandoeningen in de zwangerschap. Wij vonden behalve de door Rijnders et al. aangegeven resultaten dat bij vrouwen met preëclampsie bij wie tevens ‘haemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count’(HELPP)-syndroom ontstond, de concentratie van vrij foetaal DNA in het serum een factor 4 hoger was dan bij vrouwen met een niet door HELLP gecompliceerde preëclampsie.2 Deze verschillen in serumconcentratie van vrij DNA tussen preëclamptische zwangerschappen met en zonder HELLP waren nog duidelijker voor het vrije totale (foetale en maternale) DNA dan voor het foetale DNA (factor 18 versus factor 4,3). In 2003 hebben wij samen met een groep uit Romford (Verenigd Koninkrijk) bekeken of retrospectief in het serum van vrouwen die zwanger waren van een foetus met trisomie 21 meer vrij DNA aanwezig was dan in het serum van vrouwen met een euploïde zwangerschap. Daarbij was het opvallend dat wij in tegenstelling tot andere groepen geen verschil in vrij foetaal, maar wel in totaal DNA vonden.3 Literatuuronderzoek leerde ons vervolgens dat er opvallende verschillen in resultaten waren voor de diverse toepassingen tussen de verschillende onderzoeksgroepen die werken met vrij foetaal DNA. Een belangrijke verklaring daarvoor is het gebrek aan standaardisatie bij de kwantificering van vrij foetaal4 en totaal DNA.5 Zo worden plasma en serum door elkaar gebruikt, verschillen de opslag en voorbewerking van het bloed tussen onderzoeksgroepen, wordt DNA uit verschillende hoeveelheden plasma of serum geïsoleerd en loopt ook het aantal herhalingen uiteen dat standaard wordt uitgevoerd. Voordat vrij foetaal DNA standaard kan worden ingezet voor de diagnostiek, dient onzes inziens nog veel aandacht te worden besteed aan standaardisatie van zowel het preanalytische als het analytische traject. Het recent in het kader van het 6e ‘framework’-programma door de Europese Commissie gehonoreerde Network of Excellence, met de naam ‘Special non-invasive advances in foetal and neonatal evaluation network’ (SAFE), waar zowel de groep van collega Van der Schoot als die van ons deel van uit maken, kan daarvoor een geschikt forum blijken.

Utrecht, mei 2004,

Collega's Swinkels et al. merken op dat er gestreefd zal moeten worden naar een gestandaardiseerde en uniforme methode om celvrij foetaal en totaal DNA uit de moederlijke circulatie te isoleren, alvorens betrouwbare diagnostiek mogelijk is. Een deel van deze problematiek werd eerder ook door ons besproken.1 2 Graag plaatsen wij enkele kanttekeningen.

Wij zijn het met hen eens dat met name de hoeveelheid totaal celvrij DNA sterk afhankelijk is van de behandeling van de bloedmonsters. Een recente publicatie suggereert zelfs dat het merendeel van dit maternale DNA pas tijdens de afname en de centrifugatie van het bloedmonster uit de cellen vrijkomt.3 Om deze reden vragen wij ons af of de bepaling van de hoeveelheid circulerend vrij totaal DNA in plasma ooit een diagnostische toepassing zal kunnen krijgen. De hoeveelheid foetaal DNA is echter veel minder afhankelijk van de behandeling van het bloedmonster voorafgaande aan de isolatie. Wel zijn wij het met Swinkels et al. eens dat een gestandaardiseerde isolatiemethode noodzakelijk is indien de concentratie aan foetaal DNA ooit als diagnostische parameter of screeningsparameter bij bijvoorbeeld preëclampsie of trisomie 21 zou worden gebruikt.

Wij zouden echter willen benadrukken dat voor de niet-kwantitatieve klinische toepassingen (zoals foetale geslachtsbepaling of niet-invasieve foetale resus-D-genotypering) een uniforme isolatiemethode van het foetale DNA niet noodzakelijk is voor de reproduceerbaarheid van de bepaling. Het gaat hier immers om de aan- of afwezigheid van een te detecteren foetale gensequentie en niet om de concentratie hiervan. Binnen Europa heeft nog slechts een klein aantal laboratoria de foetale resus-D-typering in plasma ontwikkeld en zij gebruiken hiervoor verschillende technische benaderingen. Een recent mede door ons georganiseerde rondzending (in opdracht van de International Society of Blood Transfusion) laat zien dat ondanks de verschillen in isolatiemethoden tussen deze laboratoria de resultaten goed reproduceerbaar zijn. Naar onze mening is diagnostische toepassing voor niet-kwantitatieve foetale genotyperingen op dit moment dus al betrouwbaar mogelijk. Internationale samenwerkingsverbanden zoals SAFE zullen ertoe bijdragen dat onderlinge expertise wordt uitgewisseld en de mogelijke toepassingen verder worden uitgebreid.