‘Whole exome sequencing’ in de dagelijkse praktijk

De introductie van ‘whole exome sequencing’ (WES) als diagnostische test heeft een revolutionaire verschuiving binnen de klinisch-genetische zorg teweeggebracht. Voorheen was een zoektocht naar een onderliggende monogenetische oorzaak van een aandoening dikwijls kostbaar en tijdrovend. De conventionele strategie was vaak het ‘gen voor gen’ laten analyseren met de sequencing-methode van Sanger. WES maakt het mogelijk om in één keer het volledige eiwit-coderende gedeelte van het DNA (het exoom, zie de verklarende woordenlijst) te analyseren (figuur 1).

Figuur 1

Wat is ‘whole exome sequencing’?

In de afgelopen jaren zijn de WES-doorlooptijden korter geworden en de verwachting is dat deze trend zich voort zal zetten. Hierdoor wordt het voor veel meer patiënten mogelijk om binnen relatief korte tijd een moleculaire oorzaak van hun klinische beeld vast te stellen. Het vinden van een onderliggende genetische oorzaak kan voor veel patiënten handvatten bieden voor gerichte therapie, surveillance, screening en informatieverstrekking over de aandoening, inclusief de erfelijkheid ervan. Vaak is vanaf dat moment ook familieonderzoek bij gezonde familieleden mogelijk (presymptomatisch onderzoek).

In Nederland neemt de beschikbaarheid van WES binnen de geneeskundige zorg toe. Hierdoor zal deze diagnostiek steeds vaker aangevraagd worden door een gevarieerde groep van medisch specialisten. Recentelijk werd bepleit dat behandelend artsen de genetische diagnostiek of een deel daarvan zelf routinematige kunnen aanvragen.1,2 De aanvrager dient zich er dan wel bewust van te zijn dat een monogenetische afwijking niet altijd wordt gedetecteerd met WES (tabel 1). Het niet overzien van de valkuilen en de beperkingen van WES kan in potentie leiden tot het missen van een diagnose of het stellen van een onjuiste diagnose.3

Tabel 1

Beperkingen van ‘whole genome sequencing’ (WES)

Genetische oorzaken van klinische beelden die op dit moment niet met WES kunnen worden aangetoond

Whole exome sequencing

De huidige mogelijkheden

De meest aangevraagde WES-diagnostiek op dit moment betreft de WES-genpanelanalyse. Deze test geeft de mogelijkheid om gericht de belangrijkste genen die bij een bepaald klinisch beeld beschreven zijn, met één diagnostische test te analyseren. Dergelijke panels kunnen enkele tot soms wel honderden genen bevatten. Nadat de WES-gegevens van alle coderende genen gegenereerd zijn, wordt er een ‘filter-stap’ toegepast. Dit betekent dat de genvarianten van slechts een beperkte set van genen worden uitgelezen, namelijk die varianten die relevant zijn voor de klinische vraagstelling. De rest van het exoom zal niet worden geanalyseerd. Een voordeel van deze strategie is dat de kans op toevalsbevindingen relatief klein is. Voorbeelden van WES-genpanels zijn de panels voor epilepsie, verstandelijke beperking, cardiomyopathie en metabole aandoeningen.

Tot dusver zijn de opbrengstpercentages (‘diagnostic yield’) van WES vrij hoog. In studies bij personen met een verstandelijke beperking of ontwikkelingsstoornis worden percentages tot wel 43% beschreven.4-8 Dergelijke opbrengstpercentages kunnen verschillen per orgaansysteem en dus ook per genpanel. Hoge percentages zijn eveneens beschreven bij genpanels die gericht zijn op cardiomyopathie, metabole aandoeningen, retina-aandoeningen en slechthorendheid.9,10

Voor de indicaties ‘verstandelijke beperking’ en ‘multipele congenitale afwijkingen’ wordt momenteel het DNA van de ouders meegenomen in het kader van een ‘WES-trio-analyse’. Het exoom van de ouders wordt dan als referentie gebruikt bij de analyse. Deze ‘trio-benadering’ zorgt voor een betere interpretatie van de genvarianten die de novo zijn ontstaan bij de patiënt en ook voor genvarianten die passen bij autosomaal recessieve en X-gebonden aandoeningen. Vooralsnog wordt bij kleinere genpanels alleen de proband geanalyseerd, mede gezien het kostenaspect.

Wanneer een genpanelanalyse negatief is maar de verdenking op een erfelijke onderliggende oorzaak toch blijft bestaan, kan men besluiten om een WES ‘open analyse’ aan te vragen. Met WES ‘open analyse’ wordt het gehele coderende gedeelte van het genoom geanalyseerd. Dit maakt ook de kans op toevalsbevindingen groter dan bij een genpanelanalyse.

WES toont niet alle genetische afwijkingen aan

In de afgelopen jaren is de technologie achter WES sterk verbeterd. Wanneer WES-analyse echter geen verklarende moleculaire diagnose oplevert, kan er nog steeds sprake zijn van een erfelijke oorzaak. Er zijn meerdere redenen waarom een onderliggende genetische oorzaak niet met WES kan worden aangetoond. Voorbeelden hiervan staan in tabel 1, zoals genvarianten die zijn gelegen in een intron, microdeleties of microduplicaties, repeat-expansies, structurele chromosomale variaties, genvarianten in het mitochondriële DNA en DNA-methyleringsafwijkingen.

Daarnaast is het belangrijk om te beseffen dat een genvariant die in een exon gelegen is, toch met WES gemist kan worden. Dat heeft te maken met de WES-dekkingsgraad (zie Uitleg en figuur 2). De WES-dekkingsgraad van de meeste bekende ziekteveroorzakende genen is voldoende om genvarianten die in een exon gelegen zijn te detecteren. Deze dekkingsgraad kan verschillen per gen uit het geselecteerde panel en is meestal in te zien op de website van het DNA-laboratorium dat het betreffende WES-genpanel aanbiedt. Bij WES-genpanelanalyses wordt gestreefd naar een zo hoog mogelijke dekkingsgraad om de diagnostische opbrengst te optimaliseren. Wanneer de dekkingsgraad suboptimaal is voor het exon waarin de oorzakelijke genvariant gelegen is, kan deze dus gemist worden. Dit wordt meestal veroorzaakt door lastig te sequencen gebieden in het DNA.

Figuur 2

Wat houdt dekkingsgraad in?

De genetisch oorzaak kan ook gemist worden doordat het gen niet is opgenomen in het geselecteerde WES-genpanel, omdat nog niet is gerapporteerd dat het gen gerelateerd is aan het betreffende klinische beeld.

Tot slot is het mogelijk dat er sprake is van een somatisch mozaïek. Hierbij is de genvariant aanwezig in ander weefsel dan lymfocyten. Het herhalen van de WES-analyse in het aangedane weefsel kan dan een diagnostische vervolgstap zijn. Als met WES geen oorzaak wordt gevonden maar de klinische verdenking op een erfelijke oorzaak blijft bestaan, adviseren wij om te overleggen met een klinisch geneticus, bijvoorbeeld in een multidisciplinair overleg.

Interpretatie van uitslagen

Classificatie van genvarianten

De interpretatie van de resultaten van WES-diagnostiek is niet altijd eenvoudig. Klinisch-genetische laboratoria gebruiken wereldwijd een uniform classificatiesysteem om het ziekteveroorzakende karakter (de pathogeniteit) van een genvariant aan te geven. De classificatie van een genvariant varieert van klasse 1 (niet pathogeen) tot klasse 5 (zeker pathogeen) (tabel 2).11 Deze classificatie is onder andere afhankelijk van (a) de soort genvariant (missense, nonsense, frameshift, splice-site); (b) hoe sterk de veranderde base evolutionair geconserveerd is; (c) hoe vaak de genvariant voorkomt in controle-databases; en (d) eerdere rapportage van de genvariant bij patiënten met een overeenkomstig klinisch beeld.

Tabel 2

Classificatie van genvarianten

Indeling voor genvarianten die zijn gevonden met ‘whole exome sequencing’

Foutieve interpretatie

Een foutieve interpretatie van het ziekteveroorzakende karakter van een genvariant kan soms leiden tot een verkeerde diagnose en tot schade bij een patiënt of zijn familieleden. Dit kan als een valkuil gezien worden bij de interpretatie van uitslagen van DNA-diagnostiek in het algemeen, niet alleen van WES-uitslagen. Een voorbeeld hiervan is wanneer een genvariant van klasse 3 (pathogeniteit is onduidelijk) wordt geïnterpreteerd als pathogeen (klasse 5) en deze interpretatie ook als zodanig wordt besproken met de patiënt en diens familie. Wij adviseren daarom bij twijfel over het ziekteveroorzakende karakter van een genvariant te overleggen in een multidisciplinair team.

Verder is het mogelijk dat de duiding van een genvariant na verloop van tijd wordt aangepast en dat er een herclassificatie plaatsvindt wanneer meer informatie over de specifieke genvariant in de literatuur verschijnt. Ook komt het voor dat met WES in meerdere relevante genen genvarianten worden gevonden waarvan het ziekteveroorzakende karakter niet altijd duidelijk is. Alle genvarianten dienen afzonderlijk beoordeeld te worden in samenhang met het klinische beeld van de patiënt.

Ten slotte kunnen er ook meerdere pathogene genvarianten in afzonderlijke genen aanwezig zijn. Dit kan leiden tot een hybride en vaak uniek klinisch beeld. Volgens een recente publicatie komt een tweevoudige genetische diagnose voor bij 5% van de patiënten bij wie een WES-analyse werd verricht.12

Toevalsbevindingen

Alvorens WES wordt aangevraagd, is het advies om met de patiënt te bespreken dat er bij toeval afwijkingen gevonden kunnen worden en hem of haar het informed-consent-document hiervoor te laten ondertekenen, als onderdeel van voorafgaande counseling. Bij informed consent voor WES heeft de patiënt verschillende keuzemogelijkheden ten aanzien van de terugrapportage van toevalsbevindingen. In dit tijdschrift werd hier recentelijk uitgebreid bij stilgestaan.13

Toevalsbevindingen zijn pathogene genvarianten die niet direct in verband gebracht kunnen worden met de primaire vraagstelling, maar die mogelijk wel klinisch relevant kunnen zijn voor de patiënt en zijn of haar familie. Hoe meer genen de WES-analyse omvat, des te groter de kans op toevalsbevindingen. De kans op toevalsbevindingen is dan ook groter bij WES ‘open analyse’ dan bij gebruik van WES-genpanels. Bij WES ‘open analyse’ ontbreekt hierover vooralsnog uitgebreide literatuur.

De aanvrager van WES dient aan elke toevalsbevinding aandacht te schenken. Een voorbeeld van een relevante toevalsbevinding is het vinden van een pathogene genvariant in een gen dat niet te koppelen is aan het klinische beeld van de patiënt, maar wél consequenties kan hebben voor de gezondheid van de patiënt of diens familie. Dit is bijvoorbeeld het geval wanneer als toevalsbevinding een pathogene genvariant in het BRCA1 -gen wordt gevonden.

Een tweede voorbeeld van een potentieel belangrijke toevalsbevinding is het aantonen van dragerschap van een autosomaal recessieve aandoening. Als de ziekteverwekkende genvariant op het tweede allel ontbreekt, betreft het ‘slechts’ dragerschap voor deze aandoening; dit kan het klinische beeld van de patiënt vooralsnog niet verklaren. Voor de patiënt zelf heeft dragerschap daarom ook geen klinische consequenties. Dragerschap kan wel gevolgen hebben wanneer de patiënt of zijn of haar familieleden een kinderwens hebben. Een voorbeeld hiervan is dragerschap van cystische fibrose, waarbij de kans op dragerschap bij een willekeurige partner in Nederland 1:30 is.

Sleutelrol voor het multidisciplinaire overleg

De verwachting is dat WES binnen afzienbare tijd zijn intrede zal doen in de routinematige patiëntenzorg voor vele specialismen. In Engeland is al ervaring opgedaan met het gangbaar maken (‘mainstreaming’) van oncogenetische zorg.14-16 De Vereniging Klinische Genetica Nederland (VKGN) betoogt dat multidisciplinaire teams meerwaarde hebben.2 In 2015 beschreef de Gezondheidsraad dat het interpreteren van WES-gegevens van een individuele patiënt zich heeft ontwikkeld tot een multidisciplinaire taak waarbij een multidisciplinair overleg meerwaarde heeft.17 In zo’n overleg komen behandelaars, klinisch genetici en laboratoriumspecialisten samen om de gevonden genvarianten zo goed mogelijk in de context van het klinische beeld te plaatsen.

Wanneer een centrum geen multidisciplinair overleg kent, is laagdrempelig overleg met een klinisch geneticus of laboratoriumspecialist altijd mogelijk. Dit kan meerwaarde hebben wanneer uitslagen van WES-diagnostiek niet direct duidelijk zijn of wanneer geen oorzaak werd gevonden terwijl er wel een sterke verdenking op een erfelijke onderliggende oorzaak blijft bestaan.

Conclusie en toekomst

De verwachting is dat WES in de nabije toekomst gangbaarder zal worden als diagnostische standaardtest voor diverse patiëntencategorieën. Het potentieel van WES is groot en zal waarschijnlijk toenemen doordat de technische specificaties van WES alsmaar verbeteren. Toch kunnen met WES zeker niet alle erfelijke oorzaken van een monogenetische aandoening worden opgepikt. Het is belangrijk om op de hoogte te zijn van de mogelijkheden maar ook van de beperkingen van WES wanneer men deze diagnostiek aanvraagt.

Daarnaast willen wij de meerwaarde benadrukken van multidisciplinair overleg waarbij in teamverband het klinische beeld van de patiënt en de uitkomsten van WES met elkaar worden geïntegreerd.

Tot slot wijzen wij erop dat de wetenschappelijke vereniging VKGN zich tot doel heeft gesteld e-learningmodules te ontwerpen waarmee medisch specialisten zich kunnen bekwamen in het aanvragen van genoombrede diagnostiek.