16S-rRNA-sequentieanalyse

De methode

Het 16S-rDNA -gen codeert voor het kleine ribosoomdeel van het bacteriële rRNA, wat het boodschapper-RNA (mRNA) afleest. De DNA-sequentie in specifieke regio’s van het 16S-rDNA -gen is in bacteriën goed geconserveerd, waardoor in deze gebieden niet snel mutaties optreden en er gebruikgemaakt kan worden van universele bacteriële ‘primers’, de korte stukjes DNA die gebruikt wordt als startpunt van de PCR. Na de amplificatiestap van de PCR, waarin het bacteriële DNA in vitro vermeerdert, wordt de volgorde van de nucleotiden van het 16S-rDNA -gen van de bacterie bepaald: de DNA-sequentie. Vervolgens wordt de bacterie gedetermineerd door deze DNA-sequentie te vergelijken met de DNA-sequentie van bacteriesoorten in bestaande databanken.1

Meerwaarde en toepassingen

Een belangrijke toepassing van 16S-PCR is de determinatie van bacteriestammen, wanneer dat met conventionele methoden, zoals de klassieke biochemische tests of de nu veelgebruikte massaspectrometrie, niet mogelijk is. Daarnaast kan 16S-PCR gebruikt worden voor de detectie van bacteriën in klinische materialen, wanneer met andere detectiemethoden geen verwekker aangetoond wordt.2,3 Een kweekuitslag kan bijvoorbeeld fout-negatief zijn doordat materiaal afgenomen is onder antibiotische therapie, de verwekker het transport niet heeft overleefd of doordat de verwekker niet of alleen in gespecialiseerde laboratoria te kweken is, zoals geldt voor Borrelia -species.4 Een 16S-PCR biedt dan uitkomst, omdat hiermee het DNA van zowel levende als dode bacteriën kan worden aangetoond, ook wanneer de bacterie moeilijk te kweken is. In de klinische praktijk wordt 16S-PCR toegepast bij patiënten met endocarditis bij wie de bloedkweken negatief zijn en bij patiënten met meningitis of septische artritis.5,6

Een ander groot voordeel van 16S-PCR is dat het niet nodig is om vooraf te weten naar welk pathogeen je zoekt.7 De patiëntbeschrijving door Heida en collega’s is hier een goed voorbeeld van. Andere voorbeelden van verwekkers die zonder 16S-PCR niet gevonden zouden zijn, zijn Tropheryma whipplei , Bartonella quintana en Coxiella burnetii bij patiënten met kweek-negatieve endocarditis. Ook is met 16S-PCR een groot aantal pathogenen ontdekt.3

Beperkingen van de techniek

Nadelen van de 16S-PCR zijn dat de bepaling langer duurt en minder gevoelig is dan die van moleculaire tests die gericht zijn op specifieke micro-organismen. Een van de oorzaken van de lage specificiteit van 16S-PCR is dat in bijna alle reagentia DNA-sporen aanwezig zijn. Het enzym DNA-polymerase, dat het DNA amplificeert, wordt door een bacterie geproduceerd. Het is niet mogelijk om het DNA van deze bacteriën na productie van het enzym volledig te verwijderen. Ook voor de enzymcocktail die soms gebruikt wordt om de bacteriën uiteen te laten vallen, geldt dat sporen van het bacterieel DNA achterblijven in de reagentia. Met 16S-PCR wordt alle bacteriële DNA geamplificeerd en kan geen onderscheid gemaakt worden tussen het DNA van de ziekteverwekker en het DNA in de reagentia. Dit zorgt voor ruis in de uiteindelijke sequentieanalyse.

Een ander probleem is dat 16S-primers ook met menselijk DNA kunnen reageren. Daardoor is de DNA-sequentie vaak niet te beoordelen in patiëntmateriaal met een laag aantal bacteriën en een overmaat aan menselijk DNA, zoals biopten.

Er is dus een relatief grote hoeveelheid DNA van de verwekker nodig om bacterieel DNA betrouwbaar te kunnen onderscheiden van de ruis van andere DNA-sporen.8 In de praktijk betekent dit dat 16S-PCR alleen zin heeft als er in het Gram-preparaat bacteriën aanwezig zijn.3 Een uitzondering hierop zijn bacteriën die niet met conventionele microscopie te zien zijn, zoals Borrelia -species.

Tot slot moet rekening gehouden worden met de soms grote overeenkomsten in het 16S-rDNA -gen tussen bacteriën van hetzelfde genus. Dit is onder anderen het geval bij bepaalde mycobacteriën en Borrelia -species,9 waardoor het niet goed mogelijk is om onderscheid te maken tussen verschillende soorten binnen één genus van deze bacteriën. In de praktijk hoeft dit niet altijd een probleem te zijn, omdat het aantonen van een bepaald genus vaak voldoende informatie geeft om een adequate behandeling in te zetten. Dit zien we ook terug in de patiëntbeschrijving door Heida en collega’s.

De toekomst

Sinds enkele jaren kan met zogenoemde ‘high-throughput sequencing’ een groot aantal DNA-sequenties in een monster bepaald worden. Deze techniek is bijvoorbeeld van waarde voor het detecteren van ziekteverwekkers in het bloed van patiënten met sepsis. Een groot nadeel van deze methode is de gigantische hoeveelheid gegevens die ermee gegeneerd wordt. Dit komt vooral doordat in celrijk materiaal het DNA van de patiënt bijna de gehele capaciteit van de af te lezen DNA-fragmenten (‘reads’) kan innemen. Interpretatie van deze gegevens vereist veel rekenkracht van computers en kennis van bioinformatica.10

Conclusie

16S-rRNA-sequentieanalyse kan een nuttige aanvulling zijn op de reguliere microbiologische diagnostiek, wanneer met die diagnostische tests geen verwekker aangetoond wordt of determinatie van bacteriestammen niet mogelijk is. De kans op detectie en een juiste determinatie van de ziekteverwekkende bacterie is het grootst in patiëntmateriaal dat relatief weinig menselijk DNA en voldoende bacterieel DNA bevat, wat in de praktijk betekent dat er in het Gram-preparaat bacteriën te zien moeten zijn.